来源：《Journal of Agriculture and Food Chemistry》

　　标题：Phytosterols Protect against Osteoporosis by Regulating Gut Microbiota

　　作者及单位：Xiangyu Xiao, Jiaojiao Wang, Yucheng Zhu, Bohua Deng, Yucheng Liu, Shaoshuai Wang, Tao Hou,*and Tongxing Song*，华中农业大学

　　发表日期：2023.09.27

　　文章DOI：10.1021/acs.jafc.3c01489

　　摘 要：植物甾醇作为一种天然活性物质，具有缓解骨质疏松症的潜力。本研究建立糖皮质激素诱导的骨质疏松小鼠模型，再用低浓度和高浓度植物甾醇治疗4周。结果表明，与对照组相比，低浓度植物甾醇(LP)(0.3mg/mL)增加小鼠骨量，改善骨小梁微观结构，降低血清中CTX-1(I型胶原C-末端肽交联)水平，并提高1,25-二羟基维生素D3含量。此外，通过去卵巢(OVX)诱导的骨质疏松症小鼠模型进一步验证了LP在改善骨质疏松症中的作用。从机制上来说，植物甾醇通过影响肠道菌群来缓解骨质疏松症，从而提升骨骼质量。

　　摘 要：植物甾醇作为一种天然活性物质，具有缓解骨质疏松症的潜力。本研究建立糖皮质激素诱导的骨质疏松小鼠模型，再用低浓度和高浓度植物甾醇治疗4周。结果表明，与对照组相比，低浓度植物甾醇(LP)(0.3mg/mL)增加小鼠骨量，改善骨小梁微观结构，降低血清中CTX-1(I型胶原C-末端肽交联)水平，并提高1,25-二羟基维生素D3含量。此外，通过去卵巢(OVX)诱导的骨质疏松症小鼠模型进一步验证了LP在改善骨质疏松症中的作用。从机制上来说，植物甾醇通过影响肠道菌群来缓解骨质疏松症，从而提升骨骼质量。

　　1.前言

　　植物甾醇(PS)是植物中的天然活性成分，有降低胆固醇、抗炎和抗氧化活性等生理活性。研究发现，植物甾醇和β-隐黄质(β-Cx)结合可增强植物甾醇的降胆固醇作用，也降低绝经后妇女患骨质疏松症的风险。在黄羽肉鸡中补充植物甾醇，肠道拟杆菌门的相对丰度增加。但植物甾醇在调节骨质疏松症及肠道微生物群之间的潜在机制尚不明确。

　　本研究中，建立糖皮质激素诱导骨质疏松小鼠模型和OVX诱导骨质增生小鼠模型，并给模型小鼠补充植物甾醇，再从骨骼质量、血清骨代谢生化标志物以及肠道菌群变化等方面研究植物甾醇对小鼠骨骼和肠道菌群的影响，以期揭示骨质疏松症和肠道微生物群之间的关系。

　　2.试验材料与方法

　　2.1 试验材料

　　2.1.1植物甾醇(PS)，由南京诺齐生物科技有限公司提供。

　　2.1.2 试验动物：糖皮质激素诱导骨质疏松动物模型：断奶雄性C57BL/6小鼠;小鼠卵巢摘除模型OVX(雌激素缺乏骨质疏松)：3月龄雌性C57BL/6小鼠，均购自华中农业大学动物中心。

　　2.2 试验方法

　　2.2.1将糖皮质激素诱导骨质疏松模型小鼠随机分为3组，每组10只：第1组正常饮水(Con组);第2组饮用浓度为0.3mg/mL植物甾醇溶液(LP组);第3组给予0.5mg/mL植物甾醇溶液(HP组)。摄入植物甾醇22天后，收集粪便用于菌群结构分析。每组腹腔注射20 mg/kg地塞米松(Dex)，连续8天，定期记录小鼠体重。试验结束后，采集血样和骨骼样待测(图1)。

　　

 

　　2.2.2将OVX小鼠随机分为3组，即Sham组(假手术组，不切除卵巢)、OVX组和OVX+LP组。术后1周，每2天灌胃30mg/kg植物甾醇，持续8周后采集血样和骨骼样，测定胫骨骨骼质量、血清脂质和骨代谢标志物水平(图2)。

　　

 

　　2.2.3 肠道微生物DNA提取及16S rRNA基因测序(方法略，详见原文)

　　2.3 数据分析

　　体重、肌肉组织重量、血清参数和骨骼参数以平均值±SD表示，并使用GraphPad Prism 8.0通过单因素方差分析进行分析，然后进行Dunnett多重比较检验。P<0.05表示显著差异。

　　3.试验结果与分析

　　3.1 植物甾醇对糖皮质激素诱导的骨质疏松小鼠模型中骨量的影响

　　显微CT分析胫骨近端骨小梁的特征，结果表明，与对照组相比，LP显著增加骨体积(BV)、骨小梁体积分数(BV/TV)和骨小梁数量(Tb.N)(P<0.05)，表明植物甾醇有力地逆转了地塞米松诱导的骨丢失，改善骨骼退化(图3，4)。

　　

 

　　3.2 植物甾醇对OVX小鼠骨量的影响

　　与Sham组相比，OVX组小鼠的骨体积(BV)、骨小梁体积分数(BV/TV)、骨密度和骨小梁数量(Tb.N)显著降低(P<0.01)，而OVX+PS组BV、BV/TV、Tb.N较OVX组显著提升(P<0.05)(图5，6)。结合糖皮质激素诱导的小鼠实验结果，表明植物甾醇通过增加骨量来改善骨质疏松症。

　　

 

　　3.3植物甾醇对骨分解代谢的影响

　　与对照组相比，LP组血清总胆固醇(TC)水平显著降低(P<0.01)，对其余脂代谢指标无影响(图7-A)。血清CTX-1水平上调会导致骨质疏松加重，LP显著降低血清CTX-1水平(P<0.05)，但不影响骨钙素含量(图8-E)，这说明植物甾醇抑制骨骼的分解代谢。

　　1,25-(OH)2D3是肠道钙吸收的主要活性物质之。与对照组相比，LP显著提高血清1,25-(OH)2D3水平(P<0.05)(图8-F)，也有增加OVX小鼠血清1,25-(OH)2D3的浓度的趋势(图8-G)。

　　

3.4植物甾醇对糖皮质激素诱导的骨质疏松小鼠模型中肠道微生物群的影响

 

　　通过16S rRNA基因测序分析Con(H2O)和Con(H2O+Dex)组的肠道菌群组成。结果表明，注射地塞Dex后，菌群α多样性显著降低(P<0.01)，说明Dex引起了小鼠肠道菌群紊乱(图9-AB)。在门水平上，拟杆菌门、厚壁菌门、疣菌门、变形菌门和无壁菌门在Con(H2O)和Con(H2O+Dex)组中含量最高。在属水平上，有22个属的相对丰度显著不同(图9-C)。LefSe分析出了丰度差异显著且排名靠前的菌属(LDA>2)，其中包括嗜胆菌属(Bilophila)(图9-D)。

　　

 

　　分析LP(LP)和Con(H2O)以及LP(LP+Dex)和Con(H2O+Dex)组肠道菌群后发现，植物甾醇对肠道微生物群α多样性有轻微影响(图10-A)。主坐标(PCoA)分析显示，每组的菌群组成明显不同，表明植物甾醇影响了肠道菌群组成(图10-B)。在门水平上，拟杆菌门、厚壁菌门、疣菌门、变形菌门和无壁菌门在所有类群中占主导地位(图10-C)。在属水平上，有18个属在所有组中都有显著差异(图10-D)。通过LefSe分析显示，瘤胃球菌丰度(Ruminococcus)在LP(LP+Dex)和LP(LP)组中显著提升，而嗜胆汁菌丰度在Dex处理后显著增加(图10-E)。

　　

 

　　为验证植物甾醇对肠道菌群紊乱影响的关键属，进一步的研究结果表明，瘤胃球菌在LP(LP+Dex)和LP(LP)组中增加，而在Con(H2O) 和 Con(H2O+Dex)组中减少。嗜胆汁菌相对丰度的变化与瘤胃球菌在群体中的变化相反。

　　值得注意的是，瘤胃球菌和嗜胆汁菌与脂质代谢密切相关。植物甾醇显著改变的菌属的相对丰度与骨骼参数和血清TC水平高度相关。嗜胆菌属与骨参数呈显著负相关(P<0.05)，其与血清TC水平一致的趋势(P=0.06)。瘤胃球菌与骨参数呈正相关(P<0.05)，但与血清TC水平呈显著负相关(P<0.01)。这些结果表明，植物甾醇通过平衡瘤胃球菌和嗜胆汁菌的丰度来增加骨量以缓解骨质疏松症。

　　4.小结

　　植物甾醇通过调节肠道菌群，特别是平衡嗜胆菌和瘤胃球菌的丰度以促进骨量，具有抗骨质疏松的作用。